Miastu w dawnym województwie ruskim, stale nękanemu przez Tatarów, Anna z Sieniawskich, żona Wawrzyńca Spytka Jordana, postanowiła dać szansę na przetrwanie. W XVI w. wzniosła na górze, na prawym brzegu Seretu warowny zamek. Zastąpił on stary ruski gród Mikulin, wzmiankowany już w XI w. Zofia, córka Jordanów, wniosła miasteczko i warownię w wianie Samuelowi Zborowskiemu. Po śmierci Samuela dziedzicem zamku został jego syn Aleksander (zm. 1637), słynny z dzielności podczas wojen moskiewskich, który obrał sobie Mikulińce za główną siedzibę.
W 1637 od Zborowskich kupił miasteczko Stanisław Koniecpolski, hetman wielki koronny. Odbudował fortecę ze zniszczeń, formując regularne założenie na rzucie prostokąta. „Liczył się on do piękniejszych i silniejszych zamków w tych stronach”. Zamek miał piętrowe skrzydła mieszkalne o długości 75 m i głębokie piwnice. Chroniły go trzy koliste, trzypiętrowe basteje w narożach oraz południowo-zachodnie naroże chroniące nadrzeczną skarpę. Zewnętrzne mury, z łamanego kamienia, miały ponad 2 metry grubości. Na wewnętrzny dziedziniec od wschodu i zachodu prowadziły ufortyfikowane, sklepione bramy. We wszystkich ścianach zamku umieszczono strzelnice na broń ręczną. Hetman często tu bywał, a z czasem odstąpił dobra synowi Aleksandrowi, chorążemu koronnemu. Kolejnymi właścicielami byli Lubomirscy, Sieniawscy, a od 2. połowy XVIII w. Potoccy.
Kiedy w 1675 spadł na Podole najazd turecko-tatarski prowadzony przez sułtańskiego zięcia Ibrahima Szyszmana, zamku mikulinieckiego bronił rotmistrz Orchyjowski (Orchowski?) z trzema synami, na czele kilkuset szlachty, mieszczan i chłopów. Poddali się po kilkunastodniowej obronie i wyczerpaniu amunicji. Zdobywcy nie dotrzymali warunków kapitulacji: większość załogi wyrżnęli, pozostałych uprowadzili w jasyr. Orchyjowskiego z synami wbito na pale (upamiętniła ich ofiarę Z. Kossak-Szczucka w powieści Trembowla). W następnych latach zamek, obsadzony silną załogą wojskową, odgrywał jeszcze pewną rolę w ochronie pogranicza. Stracił znaczenie w XVIII w.
Miasto lokował na prawie magdeburskim w 1595 Zygmunt III. Pod koniec XVII w. Ulryk Werdum pisał: „Mikulińce to ładne miasto w samym środku jeziora, położone pomiędzy wesołymi pagórkami i krzakami. Woda otacza miasto i płynie przez nie, oddziela je też od zamku”. W 1758 August III, na prośbę Ludwiki z Mniszchów Potockiej, wdowy po hetmanie wielkim koronnym Józefie Potockim, potwierdził prawa miejskie, których później austriackie władze zaborcze nie podtrzymały.
Obok fortecy Potoccy wznieśli pałac (obecnie sanatorium), przebudowany w początku XIX w., zdewastowany i częściowo spalony w latach 1918–1919. Na osi pałacu znajduje się późnobarokowy kościół misjonarski (1761–1779) pw. Świętej Trójcy (fundacja Ludwiki z Mniszchów Potockiej). Architektoniczną perełkę zaprojektował August Fryderyk Moszyński (1731–1786), wnuk Augusta II Mocnego i hrabiny Cosel, który architektoniczne wykształcenie zdobył na dworze Augusta III (uczył się u Gaetano Chiaveriego). Jako dyrektor budowli królewskich za panowania Stanisława Augusta kierował przebudową Zamku Ujazdowskiego w Warszawie. Jego autorstwa są niezrealizowane projekty kościoła Bazylianów i nowego gmachu teatru w Warszawie oraz przebudowy kościoła Dominikanów w Tarnopolu (1770). Kościół w Mikulińcach zaprojektował na wzór drezdeńskiego Hofkirche (katolickiego kościoła dworskiego), dzieła swego nauczyciela, choć Tadeusz Jaroszewski zwrócił uwagę na podobieństwo z kościołem San Giorgio w sycylijskim miasteczku Modica i paryskim kościołem św. Rocha. Zdewastowaną w czasie II wojny świątynię (po 1945 bolszewicy umieścili tu koszary, później magazyn) zwrócono w 1989 wiernym (obecnie znajduje się w trakcie konserwacji; klasztor pomisjonarski, fundowany ok. 1780, czeka na rozpoczęcie prac). W zniszczonym wnętrzu zachowały się resztki dekoracji rzeźbiarskiej, łączonej z miejscowym snycerzem Marcinem Twardowskim, działającym w kręgu XVIII-wiecznej artystów szkoły lwowskiej.
W testamencie Ludwika Potocka zapisała Mikulińce swemu bratankowi, Józefowi Mniszchowi, po którego śmierci (przed 1799) włości nabył Piotr Konopka. W 1801 podarował miasteczko, wraz z okolicznymi wsiami, synowi Janowi. Ten założył tu kilka fabryk (m.in. największą w Galicji gorzelnię), sprowadził niemieckich kolonistów. W części pomieszczeń zamkowych urządził fabrykę sukna i warsztaty koronkarskie; pod koniec stulecia zamek przebudowano na stajnie. Konopka założył zakład kąpielowy z wodami siarczanymi na przedmieściu nazwanym Konopkówka. Wzniesiono tam obszerne i kosztowne murowane łazienki, które otaczał park angielski z dużym stawem. Zakład, jedyny taki na Podolu, cieszył się powodzeniem do czasu, kiedy rozbudowano linię kolejową umożliwiającą wyjazdy do bardziej znanych „wód”. Krajoznawca pisał z uznaniem: „Miasteczko dobrze zabudowane, handlowne i zamożne. Położenie nad podziw piękne”. Walki o spadek po Konopkach uwiecznił Aleksander Fredro w zapomnianej komedii Wychowanka. Po ślubie Józefy Konopkówny z Mieczysławem Reyem z Przecławia (1867) Mikulińce stały się własnością młodej pary.
