Po przybyciu do Knyszyna królewskiego dworu, posuwającego się w milczeniu i powoli, wraz z monarchą spoczywającym na specjalnie przygotowanym wozie z łożem, nikt nie miał nadziei na poprawę zdrowia Zygmunta Augusta. On sam, chociaż wciąż odsuwał myśl o swej śmierci, to jednak przewidywał ją, zatem 7 maja 1572 r. podyktował w wielkiej tajemnicy medykowi Augustynowi Rotundusowi, swemu sekretarzowi, testament, w którym m.in. życzył sobie, aby przy jego pogrzebie „żadne zgoła marne tego świata pompy wystawiane nie były”. Umierał przytomnie do końca, co poświadcza list lekarza Stanisława Fogelwedera do wojewody krakowskiego Jana Firleja oraz przekaz anonimowego dworzanina, który twierdził, że król „do samej śmierci był dobrej pamięci”.
Przyczynę zgonu współcześni komentowali rozmaicie. Według Świętosława Orzelskiego Zygmunt August zmarł na suchoty (co zdają się potwierdzać ówczesne relacje o krwotokach i bólach w boku), a śmierć przyśpieszyło rzekomo zażycie napoju miłosnego. Ostatni Jagiellon zamknął oczy 7 lipca 1572 r. o godzinie 6 po południu. Obecni tam senatorowie opieczętowali komnaty, w których mieściły się rzeczy po królowej Barbarze, srebra i inne cenne przedmioty, lecz niemal natychmiast rozpoczęło się rabowanie królewskich skarbów przez kamarylę Mniszchów. Ledwo ostygłym ciałem monarchy nikt się nie interesował. Cytowany Orzelski wspominał, iż „zaledwie znaleźli się ludzie, co by koło zwłok zmarłego króla mieli staranie, bo pozmykali najpoufalsi królewscy ulubieńcy”. Podobnie wypowiadał się Kasper Irzykowicz, podkomorzy mielnicki i poseł na sejm 1569 r., w liście wysłanym 18 lipca 1572 r. do nieznanego korespondenta: „I kochankowie jego zaraz od ciała uciekli i stamtąd się wyprowadzili...”. Dworzanie opowiadali Orzelskiemu, że po śmierci króla „taki okropny widok opuszczenia przedstawiał nieboszczyk, iż nie było czym przykryć nagi trup jego. Dopiero biskup [Krasiński] kazał zrobić całun na ten użytek, a doktor Fogelweder włożył na ciało zmarłego złoty pierścień z kosztownym kamieniem i łańcuch złoty z krzyżem nabyty niegdyś przezeń prawem spadku po Andrzeju Zebrzydowskim, biskupie krakowskim”. Potwierdził to również Reinhold Heidenstein pisząc: „Wielu odbiegło go zaraz po śmierci i tak ciało jego zaniedbane leżało i kiedy nikt się o niego nie troszczył, Stanisław Czarnkowski, referendarz wielki koronny, kazał własnym sumptem suknie i inne rzeczy do ubrania ciała sprawić”.
Czy relacje Orzelskiego i Irzykowicza są w pełni wiarygodne? Można w to wątpić, skoro o tak skandalicznym opuszczeniu zwłok królewskich zupełnie nie wspominał sekretarz posła francuskiego Jean Choisnin, który skwapliwie notował wszystko, co działo się w Knyszynie. Faktem jest jednak, iż w skarbcu królewskim znaleziono tylko 10 tysięcy czerwonych złotych (według innych relacji 75 tysięcy), bo – jak irytował się wspomniany Irzykowicz „jedno kochankowie pobrali, pierzynki uwięzując z okna wyciekali, drugie się kurwom rozdało, jako się już Giżanka zna, że ma 10 000 w zachowaniu czerwonych złotych przy sobie”.
Ciało królewskie wystawiono na katafalku. „Tak ubrany leżał król Zygmunt na katafalku – pisał Choisnin – otoczony świec mnóstwem i pochodni, strzeżony we dnie i w nocy od kapłanów, którzy śpiewali, i kilku z szlachty, którzy pilnowali królewskiego ciała”. Zwłoki Zygmunta Augusta przebywały w Tykocinie do 10 września 1573 r., skąd przewieziono je do Warszawy, a potem do Krakowa (styczeń 1574 r.).
